ELISA实验：你的耗材试剂选对了吗？
ELISA实验：你的耗材试剂选对了吗？
成功的ELISA方法的开发关键，在于对ELISA实验中所使用的试剂耗材的选择和搭配。
对试剂耗材的特性和多样性的了解，有助于在不同的实验需求中寻找合适的组合搭配中开发高质量的ELISA方法。
①酶标板材：
市面上提供的酶标板材基本都是多聚苯乙烯，产品线比较齐全的公司会对多聚苯乙烯材质的多种化学修饰以相对于包被的蛋白具有不同的特性。
一般的酶标板材的说明书上会根据高结合力（Highbinding），中结合力（mediumbinding）的维度进行划分。
但笔者以多年的从业经验出发，会更信任以亲水，弱亲水，未处理和疏水四个等级划分酶标板材的类型和特性的酶标板材。
一般来说，酶标板材由亲水到疏水，对蛋白的结合会由强逐渐变弱，这会带来三个效果：
相同浓度的蛋白包被，结合能力强的比结合能力弱的材料可以在酶标板材上固定更多的蛋白，因为单孔亲水板材的*大吸附抗体量是220ng，而疏水板材只有100ng。
由亲水到疏水，板材对包被蛋白的吸附效率提高的同时，其对ELISA反应过程中样品蛋白、样品溶液中的其他蛋白和酶联抗体的非特异吸附的能力也会提高，从而造成非特异信号。
包被的蛋白作为一个大分子以一个表面吸附在酶标板材上，其表面在不同酶标板材上并不是大多数人想象中的随机均匀的，有明显的偏向性，会导致在不同的特性酶标板材上，包被蛋白与酶标板材的接触表面不一样，从而造成不同的位点被屏蔽的现象。如果这个位点恰好是与检测样品结合的位点，样品将会因此无法被检测到。
ELISA实验：你的耗材试剂选对了吗？所以一个专注多样化ELISA方法开发的实验室应该准备多种不同特性的酶标板材以供选择。
②包被液：
常用的包被液是PBS（pH 7.4）或者碳酸钠-碳酸氢钠溶液pH
9.6，pH和离子浓度会对包被的效率产生一定的影响，需根据包被蛋白的特性进行具体分析，包被蛋白溶液经过包被后也不会都吸附在酶标板材上，包被完成后大部分蛋白还是留在溶液中。
文献中有记载蛋白溶于包被液后抽真空使包被蛋白以更高的密度吸附在酶标板材上的案例。
③封闭剂：
常用的封闭剂有3%BSA（w/v），5%脱脂奶粉（w/v）等。
封闭液的作用是覆盖酶标板材包被蛋白占据位置以外的空间，以抵抗后续样品或者样品中的其他物质、酶联抗体等对于板材直接的非特异吸附。
根据笔者多年的实践经验，封闭剂只能对成分简单的样品溶液起到较好的封闭作用但面对成分比较复杂的样品溶液，封闭效果则会大打折扣。
有研究表明，封闭剂的封闭效果和封闭分子的大小成反比，所以如果传统的封闭剂起不到很好的封闭效果，选用分子量更小的封闭剂（如：酪蛋白），可能会取得更好的封闭效果。
另外需特别注意：如果检测体系是生物素-链霉亲和素体系，千万不要使用脱脂奶粉作为封闭剂——因为脱脂奶粉中含有生物素，会对检测体系造成干扰。
④洗涤液/稀释液：
常用的洗涤液是中性的缓冲液加上一定浓度的去污剂如PBST (0.05%(V/V) Tween-20 in PBS)。
稀释液会在洗涤液中加入一定的封闭剂成分如0.5%BSA (W/V ) in PBST。
在一些体内样品的检测过程中，通常会在稀释液中加入一定浓度的阴性血清，以使得不同稀释度的样品有相同的非特异背景。
⑤酶联抗体：
酶联抗体的种类很多，可根据抗体的作用位点分为特异性酶联抗体和通用型酶联抗体。
特异性酶联抗体作用于特定蛋白的表位上。
通用型酶联抗体则往往针对于多肽序列组成的标签，生物素，特定种属抗体的Fc端保守区域等。
常用的酶联抗体标记的酶主要为AP（碱性磷酸酶）和HRP（辣根过氧化氢酶）。
酶联抗体根据其抗体的成分可分为单抗酶联抗体和多抗酶联抗体。
其中多抗酶联抗体的多抗成分一般是通过**兔或者山羊得到的，成分比较复杂，需格外注意其与ELISA体系中其他试剂的交叉反应。
酶联抗体根据其抗体的分子量由大到小可分为全长的酶联抗体、Fab片段酶联抗体、scFv酶联抗体。
分子量越小的酶联抗体越有可能避免和样品蛋白结合时可能存在的作用位点被空间阻碍的情况，但也进一步增加了酶联抗体绕过封闭剂的阻断与酶标板材进行非特异结合的风险。
⑥显色液和酶标仪：
显色液的选择需与酶联抗体的酶对应，也需和实验室所具备的酶标仪对应。
如酶联抗体偶联的是HRP（辣根过氧化氢酶），可以采用TMB显色液，用能够进行吸光度读数的酶标仪进行检测；
或者Ampliflu™Red为底物，用能够进行荧光读数的酶标仪进行检测；亦或采用QuantaRedADHP为底物，用能够进行化学发光读数的酶标仪进行检测。
一般来说，ELISA方法的灵敏度会受到底物的检测方法限制，化学发光底物能够检测的信号下限要优于荧光底物，再优于吸光度值底物。
即使是常用的TMB显色液，很多供应商不同显色强度的显色液，可以根据方法开发过程的具体情况合理选择显色液。