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ELISA定量方法的类型和构架

日期:2024-03-28 18:46
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摘要:ELISA定量方法的类型和构架从事生物药研发的你,不可不知的ELISA开发方法|干货满满!快来看看ELISA在生物药研发中的直接法实验方案吧!

ELISA定量方法的类型和构架从事生物药研发的你,不可不知的ELISA开发方法|干货满满!快来看看ELISA在生物药研发中的直接法实验方案吧!

ELISA定量方法的类型和构架前言

ELISA在生物**研发的各个环节均有广泛的应用:

如以生物大分子检测为目的,在药效药代评估时,对动物实验和临床实验中的血液样品的**浓度和生物大分子标志物进行定量检测;

以亲和力测定为目的,在质量分析过程中,对抗体相对于靶点抗原的亲和力检测;

以亲和力筛选为目的,在抗体发现过程中,对杂交瘤细胞克隆上清分泌抗体相对于靶点抗原的亲和力大小进行区分等。

使用目的不同,则需要选取不同特性试剂耗材。

参差多态方显世界精彩,ELISA方法学开发也是一个道理。

本篇为ELISA方法开发构建的的几大实例之一——生物大分子检测的定量方法开发的具体实验方案,适用于所有初接触ELISA方法技术且有志于进行ELISA方法开发建立的同仁。

ELISA定量方法的类型和构架

采用ELISA技术进行定量的平台化方法——一般来说可以分为两类,即间接法和直接法。

间接法也称为竞争法,直接法也称双抗夹心法。

今天,我们重点为大家介绍直接法。

直接法以定量抗原为例:

首先,以与抗原有强亲和力的抗体包被固定在酶标板材上,加入抗原标准品/样品反应,再加入与抗原有强亲和力的抗体并且偶联了辣根过氧化氢酶HRP/碱性磷酸酶AP的酶联抗体反应,*后加入酶对应的底物显色,中间通过洗涤去除反应体系中未结上的试剂成分。

这样信号大小和抗原的浓度成正相关,随着反应的进行酶标板材上固定的成分由抗体,转变为抗体-抗原,*后变为抗体-抗原-酶联抗体,待测的抗原处于两个抗体之间,所以也称为双抗夹心法。

双抗夹心法有一个关键点:待检测的物质(如抗原)必须给包被抗体和酶联抗体提供两个结合位点,这两个位点可以是抗原上两个以上相同的结构位点,也可以是不同的结构位点。

一般来说,Elisa的构架由标准品,内控品,空白对照,基质对照和待测样品组成。

标准品
根据实验的具体应用方向来源,标准品可以是已知浓度的国际/国家标准品或者商业化的已知浓度的蛋白分子,也可以是自制的以其他方式定量(如紫外吸收定量)的纯度较高的蛋白分子。标准品一般为7-8个浓度点,拟合成合适的浓度-信号剂量曲线作为标准曲线进行内控品和样品的定量。

内控品
其中,内控品是能够长期使用的、独立分装的、特定浓度(高中低)的标准品,是监控ELISA实验在单次实验中的质量和长期的应用过程中不同批次标准品的过渡桥接。

空白对照
空白对照为不含标准品的标准品溶液,基质对照则为不含样品的样品溶液——两者可能是一样的成分,也可能是不同的成分,需要根据实验的具体情况进行区分,目的是确认ELISA体系中是否有非特异的交叉反应。
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